Die kombinierte Analyse des Proteoms und Metaboloms liefert Einblicke in die microRNA

Aug 02, 2023

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 271 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pathogene Viren können durch weibliche Aedes aegypti (Ae. aegypti)-Mücken bei der Aufnahme von Blutmehl von Wirbeltieren übertragen werden. Die Stummschaltung der mücken- und mitteldarmspezifischen microRNA (miRNA) 1174 (miR-1174) beeinträchtigt die Blutaufnahme und erhöht die Sterblichkeit. Die Bestimmung der Identität der Proteine ​​und Metaboliten, die auf den Abbau von miR-1174 reagieren, wird unser Verständnis der molekularen Mechanismen dieser miRNA bei der Steuerung der Bluternährung und des Nährstoffstoffwechsels von Mücken verbessern.

Antisense-Oligonukleotide (Antagomire [Ant]) Ant-1174 und Ant-Ct wurden in weibliche Ae injiziert. Aegypti-Mücken 12–20 Stunden nach der Eklosion und die Abreicherung von miR-1174 wurde durch quantitative Echtzeit-PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) bestätigt. Mit Ant-1174 injizierte Mücken und Kontrollmücken wurden vor der Blutmahlzeit 72 Stunden nach der Injektion für eine Tandem-Massen-Tag-basierte Proteomanalyse und eine Flüssigchromatographie-Tandom-Massenspektrometrie-Nichtziel-Metabolomanalyse gesammelt, um unterschiedlich exprimierte Proteine ​​bzw. Metaboliten zu identifizieren. RNA-Interferenz (RNAi) mittels doppelsträngiger RNA-Injektion (dsRNA) wurde angewendet, um die biologischen Rollen dieser unterschiedlich exprimierten Gene zu untersuchen. Der RNAi-Effekt wurde durch RT-qPCR- und Western-Blot-Assays verifiziert. Der Triglyceridgehalt und die ATP-Werte wurden mit den entsprechenden Testkits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Statistische Analysen wurden mit der GraphPad7-Software unter Verwendung des Student-t-Tests durchgeführt.

Nach der Erschöpfung des mücken- und mitteldarmspezifischen miR-1174 wurden insgesamt 383 differentiell exprimierte Proteine ​​(DEPs) identifiziert, von denen 258 hochreguliert und 125 herunterreguliert waren. Die Funktionsanalyse dieser DEPs mittels Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Anreicherung legte nahe, dass miR-1174 wichtige regulatorische Rollen im Aminosäurestoffwechsel, Nukleotidstoffwechsel, Fettsäurestoffwechsel und Zuckerstoffwechsel spielt. Insgesamt wurden 292 Differenzialmetaboliten identifiziert, von denen 141 hochreguliert und 151 herunterreguliert waren. Die integrative Analyse zeigte, dass die damit verbundenen Differenzproteine ​​und Metaboliten hauptsächlich in einer Vielzahl von Stoffwechselwegen angereichert wurden, darunter Glykolyse, Citratzyklus, oxidative Phosphorylierung und Aminosäurestoffwechsel. Insbesondere war das Gen eines hochregulierten Proteins in miR-1174-depletierten Mücken, Purinnukleosidphosphorylase (PNP; AAEL002269), mit den Stoffwechselwegen Purin, Pyrimidin und Niacin-Nicotinamid assoziiert. Der Abbau von PNP führte zu einer erheblichen Hemmung der Blutverdauung und der Entwicklung der Eierstöcke und erhöhte die Sterblichkeit bei Erwachsenen. Mechanisch führte die PNP-Depletion zu einer signifikanten Herunterregulierung des Vitellogenin-Gens (Vg); Darüber hinaus waren einige wichtige Gene in den Ecdyson-Signalwegen und Insulin-ähnlichen Peptid-Signalwegen im Zusammenhang mit der Eierstockentwicklung betroffen.

Diese Studie zeigt die unterschiedliche Akkumulation von Proteinen und Metaboliten in miR-1174-depletierten Ae. Aegypti-Mücken mithilfe proteomischer und metabolomischer Techniken. Die Ergebnisse liefern funktionelle Beweise für die Rolle des hochregulierten Gens PNP bei den physiologischen Aktivitäten des Darms. Unsere Ergebnisse verdeutlichen wichtige molekulare Veränderungen in miR-1174-depletierten Ae. Aegypti-Mücken und liefern somit eine Grundlage und neue Erkenntnisse für ein besseres Verständnis des molekularen Mechanismus, der an einer linienspezifischen miRNA in Mückenvektoren beteiligt ist.

Weibchen von Vektormückenarten entnehmen Blut von Wirbeltieren, um die Aminosäuren und andere Nährstoffe zu erhalten, die für die Eientwicklung benötigt werden. Folglich dienen sie als Überträger einer Vielzahl viraler Krankheitserreger. Mit der globalen Urbanisierung und der kontinuierlichen Erwärmung des Klimas steigt weltweit das Risiko von durch Mücken übertragenen Krankheiten, was eine ernsthafte Herausforderung für die öffentliche Gesundheit darstellt und für viele Länder erhebliche wirtschaftliche Belastungen mit sich bringt [1]. In den letzten Jahren haben eine Reihe vielversprechender Strategien und Technologien zur Bekämpfung von Mückenvektoren auf der Grundlage genetischer Manipulation an Akzeptanz gewonnen [2,3,4,5]. Der Mangel an wirksamen medizinischen Interventionen schränkt jedoch immer noch die Prävention und Bekämpfung der meisten durch Mücken übertragenen Krankheiten ein.

Das Verständnis der Regulierungswege im Nährstoffstoffwechsel von Vektormücken ist für die Prävention und Bekämpfung von durch Mücken übertragenen Viruserkrankungen von entscheidender Bedeutung. Bei der weiblichen Mücke sind wichtige Wege im Kohlenhydratstoffwechsel mit dem hohen Energiebedarf der Fortpflanzung synchronisiert [6]. Die von Mücken aufgenommenen Aminosäuren und Proteine ​​im Blut von Wirbeltieren liefern die gewünschten Nährstoffe, die für die Entwicklung der Eierstöcke benötigt werden. Daher ist ein normaler Stoffwechsel von Aminosäuren entscheidend für die Vermehrung von Mücken.

In früheren Studien haben wir gezeigt, dass die mücken- und darmspezifische microRNA (miRNA)-1174 (miR-1174) die Zuckerverwertung, Blutabsorption, Eierstockentwicklung und Eiablage durch ihr Zielgen Serinhydroxymethyltransferase (SHMT) steuert [7]. Wir fanden auch heraus, dass die Unterdrückung von SHMT die Blutabsorption der Mücken nicht beeinträchtigt, aber die Blutverdauung blockiert, sodass Mücken ihre Flugfähigkeit verlieren, die Entwicklung der Eierstöcke stagniert und die Laichrate verringert wird [8]. Das SHMT-Protein katalysiert die Kreuzumwandlung von L-Serin und Glycin [9, 10]. Die Purin- und Pyrimidin-Biosynthese wird gehemmt, wenn die SHMT-Aktivität reduziert wird [11]. Obwohl die miR-1174-SHMT-Achse im Darm von Mücken eine wichtige Rolle spielt, sind die molekularen Mechanismen der miR-1174-Wirkung in physiologischen Prozessen wie der Blutverdauung, der metabolischen Homöostase und der Fortpflanzung noch weitgehend unbekannt.

Wir haben die vorliegende Studie durchgeführt, um mithilfe von Proteomik- und Metabolomik-Techniken die auf miR-1174 reagierenden Signalwege zu entschlüsseln, die an den biologischen Prozessen von Mücken beteiligt sind. Wir analysierten die Funktionen der unterschiedlich exprimierten Proteine ​​und Metaboliten mithilfe der Anreicherung von Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Die Integration von Proteomik und Metabolomik wurde durchgeführt, um die Signalwege für diese unterschiedlich exprimierten Proteine ​​und Metaboliten zu identifizieren. Die biologischen Rollen dieser auf miR-1174 reagierenden Gene wurden mittels RNA-Interferenz (RNAi) untersucht. Insbesondere führte der Abbau des Gens, das für Purinnukleosidphosphorylase (PNP) kodiert, zu einer ernsthaften Hemmung der Blutverdauung und der Entwicklung der Eierstöcke und verkürzte die Lebenserwartung erwachsener Mücken. Unsere Arbeit erweitert und vertieft das aktuelle Wissen über den Regulationsmechanismus von mückenspezifischem miR-1174 und könnte ein neues Ziel für die Entwicklung neuartiger Techniken zur Mückenbekämpfung auf molekularer Ebene darstellen.

Ae. Aegypti-Mücken (Stamm NIH Rockefeller), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden wie zuvor berichtet gezüchtet [8]. Kurz gesagt, die Ae. Die Aegypti-Stammkolonie wurde bei 28 °C und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit unter einer 12/12-stündigen Licht-/Dunkel-Photoperiode aufgezogen. Die Larven wurden in Wasser aufgezogen, dem eine künstliche Nahrung aus Hefe und Rattenfutter (Verhältnis 1:1) zugesetzt wurde. Erwachsenen Mücken wurden vor und nach einer Blutmahlzeit ein mit Wasser getränktes Wattepad und ein mit 10 %iger Glucoselösung getränktes Wattepad zur Verfügung gestellt. Drei bis vier Tage alte weibliche Mücken durften sich von mit Isofluran betäubten weißen Ratten ernähren. Laborwirbeltiere wurden gemäß den vom Southwest University Animal Care and Use Committee genehmigten Richtlinien gehalten. Um Mückenindividuen und -gewebe nach einer Blutmahlzeit zu entnehmen, wurde der Blutbolus aus dem Darm entfernt, indem man ihn mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop zusammenklemmte. Mückengewebe wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) präpariert. Alle Experimente in dieser Arbeit wurden nur an erwachsenen weiblichen Mücken durchgeführt.

Mücken mit oder ohne Blutmahlzeit wurden mit 10 %iger Glucoselösung in einem Inkubator mit künstlichem Klima gefüttert, der bei 28 °C und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wurde. Antisense-Oligonukleotide (Antagomire [Ant]) Ant-1174 und Ant-Ct wurden von Dharmacon Inc. (Lafayette, CO, USA) gekauft und 12–20 Stunden nach der Eklosion (PE) in erwachsene weibliche Mücken injiziert, wie zuvor beschrieben [7]. Drei biologische Replikate wurden sowohl für die mit Ant-1174 injizierte (Ant-1174) als auch für die Kontrollgruppe festgelegt, mit 60 weiblichen und 30 männlichen Mücken in jedem Käfig. Die mit Ant-1174 injizierten Weibchen und Kontrollen wurden vor einer Blutmahlzeit 72 Stunden nach der Injektion (PIJ) gesammelt und 20 Weibchen, die zufällig aus jedem Käfig ausgewählt wurden, in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei − 80 ℃ vor Gebrauch. Sechs Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf Co., Eppendorf, Hamburg, Deutschland) mit Proben (Ant-1174: Kontrolle = 3:3) wurden zur Proteomikanalyse an Shanghai Biotree Biomedical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) geschickt. Das Gesamtprotein jeder Probe wurde extrahiert, quantifiziert, reduziert, alkyliert und zu Peptiden verdaut. Die Peptide wurden mit einem iodoTMTsixplex Isobaric Mass Tag Labeling Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert und anschließend entsalzt. Eine 2-µg-Probe der TMT6-markierten Peptide wurde mithilfe einer Nano-Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC) übertragen, die an ein Q Exactive HFX Orbitrap-Gerät (Thermo Fisher Scientific) gekoppelt war, das mit einer Nano-Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet war. Die erhaltenen Massenspektrometriedaten wurden zum Screening in die Proteome Discoverer-Software (PD) (Version 1.4.0.288; Thermo Fisher Scientific) eingegeben. Die Screening-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Elternionen-Massenbereich: 400–5000 Da; Mindestanzahl an Peaks im sekundären Massenspektrum: 10; Schwellenwert für Signal-Rausch-Verhältnis (S/N): 1,5. Das aus dem PD-Screening erhaltene Massenspektrum wurde mit der Software-Suchmaschine Mascot (Version 2.3.2) weiter durchsucht, gefolgt von qualitativen und quantitativen Analysen auf Basis der UniProt-Datenbank [12]. Die ursprünglichen Daten umfassten 5892 Proteine, die aus sechs experimentellen Proben extrahiert wurden (Zusatzdatei 1: Tabelle S1), von denen 5875 Proteine ​​nach der Vorbehandlung erhalten blieben (Zusatzdatei 2: Tabelle S2). DEPs wurden nach folgenden Kriterien gescreent: P-Wert < 0,05 und Foldchange < 0,83 oder > 1,2, wie in anderen Studien beschrieben [13, 14, 15, 16] (Zusatzdatei 3: Tabelle S3). Die DEPs wurden einer GO-Anreicherungsanalyse (17) und einer KEGG-Signalweganreicherungsanalyse (18) unterzogen.

Ant-1174 und Ant-Ct wurden den weiblichen erwachsenen Mücken wie oben für die Proteomanalyse beschrieben injiziert. Weibliche Mücken wurden ebenfalls vor einer Blutmahlzeit nach 72 Stunden PIJ gesammelt. Sowohl die Ant-1174-injizierte Gruppe (Ant-1174) als auch die Kontrollgruppe enthielten acht biologische Replikate mit 30 weiblichen Mücken in jeder Gruppe, was 16 Eppendorf-Röhrchen mit Proben ergab, die für die Nichtziel-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vorbereitet wurden Metabolomik. Alle gesammelten Proben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, in Trockeneis eingewickelt und zur LC-MS/MS-Analyse an Shanghai Biotree Biotechnology Co., Ltd. geschickt. Um die Metaboliten zu extrahieren, wurden 50 mg jeder Probe in ein Eppendorf-Röhrchen eingewogen, das 1000 μl Extraktlösung (Acetonitril:Methanol:Wasser = 2:2:1, mit einer isotopenmarkierten internen Standardmischung) enthielt. Als Qualitätskontrollprobe (QC) diente eine Mischung aus einem gleichen Aliquot der Überstände aller Proben. Alle Proben wurden auf einem UHPLC-Vanquish-System (Thermo Fisher Scientific) mit einer UPLC-BEH-Amid-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) analysiert, die an ein Q Exactive HFX-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) gekoppelt war. Wir haben sowohl den positiven Ionenmodus (POS) als auch den negativen Ionenmodus (NEG) in der QE-Ionisationsquelle des Elektrospray-Ionisationssystems (ESI) übernommen. Die mobile Phase A bestand aus 25 mM/l Ammoniumacetat oder 25 mM/l Ammoniakhydroxid in Wasser (pH = 9,75) für den POS- bzw. NEG-Modus. Die mobile Phase B war für beide Modi Acetonitril. Der Elutionsgradient für die Analyse wurde wie folgt eingestellt: 0–0,5 min, 95 % B; 0,5–7,0 Min., 95–65 % B; 7,0–8,0 Min., 65–40 % B; 8,0–9,0 Min., 40 % B; 9,0–9,1 Min., 40–95 % B; 9,1–12,0 min, 95 % B. Die Säulentemperatur betrug 30 °C; die Temperatur des Autosamplers betrug 4 °C; und das Injektionsvolumen betrug 2 μl. Das AQ Exactive HFX-Massenspektrometer wurde zur Auswertung von MS/MS-Spektren im informationsabhängigen Erfassungsmodus unter Steuerung der Erfassungssoftware Xcalibur (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die ESI-Quellenbedingungen wurden wie folgt eingestellt: Hüllgasdurchflussrate: 50 Arb; Hilfsgasdurchfluss: 10 Arb; Kapillartemperatur: 320 °C; volle MS-Auflösung: 60.000; MS/MS-Auflösung: 7500; Kollisionsenergie: 10/30/60 im NCE-Modus; Sprühspannung: 3,5 kV (positiv) oder − 3,2 kV (negativ).

Die oben beschriebenen Metabolomics-Rohdaten wurden mit der ProteoWizard-Software [19] in das mzXML-Format konvertiert und dann mit dem XCMS-Programm R-Paket XCMS (v3.5) [19] verarbeitet, gefolgt von Peak-Vorbehandlungen einschließlich Erkennung, Extraktion, Ausrichtung und Integration. Die verbleibenden Peaks wurden durch Vergleich mit den Indizes für Retentionszeit und Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) in den Online-Datenbanken HMDB (https://hmdb.ca/) [20] und KEGG (http://www .genome.jp/kegg) sowie in der hauseigenen MS2-Datenbank (Biotree DB). Der Grenzwert für die Annotation wurde auf 0,3 festgelegt. Im POS-Modus wurden 7003 Peaks aus drei QC-Proben und 16 experimentellen Proben extrahiert und 5714 Peaks wurden nach der Vorbehandlung beibehalten (Zusatzdatei 4: Tabelle S4). Im NEG-Modus wurden 7179 Peaks aus drei QC-Proben und 16 experimentellen Proben extrahiert und 5609 Peaks wurden nach der Vorbehandlung beibehalten (Zusatzdatei 5: Tabelle S5). Insgesamt wurden 14.113 Peaks aus den kombinierten POS- und NEG-Modi extrahiert und 11.270 Peaks blieben nach der Vorbehandlung erhalten (Zusatzdatei 6: Tabelle S6). In der anschließenden Datenanalyse wurden die Daten aus den Modi POS und NEG schließlich zusammengeführt.

Zur Visualisierung der Verteilung und Gruppierung der Proben wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) [21] durchgeführt, eine unbeaufsichtigte Analyse, die die Dimensionen der Daten reduziert. Ein 95 %-Konfidenzintervall (CI) (Hotellings T-Quadrat-Ellipse) im PCA-Score-Diagramm wurde als Schwellenwert verwendet, um potenzielle Ausreißer im Datensatz zu identifizieren. Die orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) [22, 23] wurde angewendet, um die Gruppentrennung weiter zu visualisieren und signifikant veränderte Metaboliten zu identifizieren. Die Metaboliten mit variabler Bedeutung in der Projektion (VIP) > 1 und P < 0,05 (ungepaarte zweiseitige Student-t-Tests) im OPLS-DA-Modell wurden als differentiell exprimierte Metaboliten (DEMs) betrachtet. Vulkandiagramme und eine hierarchisch gruppierte Heatmap wurden erstellt, um signifikante Merkmale der identifizierten DEMs zu visualisieren. Kommerzielle Datenbanken, einschließlich KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) und MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca/), wurden für die Analyse der Signalweganreicherung verwendet. Abschließend wurde eine integrierte Analyse des Proteoms und Metaboloms für die unterschiedlichen Proteine ​​und Metaboliten durchgeführt.

Wir haben die 3'-untranslatierten Regionen (3'-UTRs) von Ae heruntergeladen. aegypti von VectorBase (https://vectorbase.org/vectorbase/app) und sagte die Kandidatenziele von miR-1174 mithilfe von RNAhybrid [24], miRanda [25], TargetScan [26] und Target Accessibility (PITA) [27] voraus. Die vorhergesagten Zielkandidaten wurden mit den hochregulierten Proteinen gekreuzt, was die endgültigen Zielkandidaten ergab. Die 3′-UTRs dieser Kandidaten-Zielgene wurden durch schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (3′-RACEs) amplifiziert und nach Verdauung mit den Restriktionsenzymen Not I und Xho I in den psiCHECK™-2-Vektor kloniert. Der miR-1174 Das für die Zelltransfektion verwendete Mimetikum wurde von Thermo Fisher Dharmacon (Thermo Fisher Scientific) erworben. Die drei Kandidaten-Zielgene wurden schließlich durch einen Dual-Luciferase-Reporter-Assay auf dem GloMax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI, USA) verifiziert, wie in unserer vorherigen Arbeit beschrieben [28]. Die Zelllinie HEK-293T, der Vektor psiCHECK™-2 und Reagenzien für den Dual-Luciferase-Reporter-Assay (Dual-Glo® Luciferase Assay Reagent und Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent) wurden von Promega erworben.

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz (Life Technologies, Carisbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert und dann mit einem Nano 300-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. RNA mit einer optischen Dichte (OD) 260/280 > 1,8 wurde für nachfolgende Experimente als zufriedenstellend angesehen. Die Integrität der extrahierten RNA wurde durch 1 % Agarosegelelektrophorese überprüft. Alle Primerpaare für die quantitative Echtzeit-PCR-Amplifikation (RT-qPCR) von Genen wurden mit der Software Primer Premier 5.0 entworfen und dann bei Sangon Biotech (Shanghai, China) synthetisiert (zusätzliche Datei 7: Tabelle S7). Um die Expression der proteinkodierenden Gene zu untersuchen, wurde 1 µg Gesamt-RNA mithilfe des SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan) revers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. RT-qPCR wurde unter Verwendung von TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.) durchgeführt. Das Reaktionsvolumen (20 µl) enthielt 10 µl 2× NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Peking, China), 0,8 µl 10 µM Primer, 0,4 µl ROX Dye II, 2 µl verdünnte cDNA und 6,8 ​​µl ddH2O. Als interne Kontrolle diente das ribosomale Protein S7 (RPS7; AAEL009496-RA). Die Reaktionen wurden auf einem ABI7500 Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Das Amplifikationsverfahren war: Vorbehandlung bei 95 °C für 1 Minute; gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 1 Minute und 60 °C für 1 Minute; endet mit der Erstellung der Auflösungskurven bei 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min und 95 °C für 15 s. Um das Expressionsniveau von miR-1174 zu untersuchen, wurde 1 µg Gesamt-RNA unter Verwendung des SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Peking, China) revers in cDNA transkribiert. RT-qPCR wurde unter Verwendung eines miRNA Universal SYBR qPCR Mix (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.) durchgeführt. Das Gesamtreaktionsvolumen (20 µl) enthielt 10 µl miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0,8 µl 10 µM Primer, 0,4 µl 50× ROX Reference Dye II, 2 µl verdünnte cDNA und 6,8 µl ddH2O. Als interne Kontrolle wurde kleine nukleare RNA (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) verwendet. Die Reaktionen wurden auf dem Echtzeit-PCR-System ABI7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung des folgenden Amplifikationsverfahrens durchgeführt: Vorbehandlung bei 95 °C für 1 Minute; gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s; endet mit der Erstellung der Auflösungskurven bei 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min und 95 °C für 15 s.

Die Gesamt-RNA wurde wie oben beschrieben mit TRIzol-Reagenz aus Mücken extrahiert. Die Erststrang-cDNA wurde mit dem SuperScript™ IV Erststrang-Synthesesystem (TaKaRa Bio Inc.) generiert. Die PCR wurde mit der Platinum™ PCR SuperMix High Fidelity-Mischung (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) gemäß den folgenden Verfahren durchgeführt: 94 °C für 2 Minuten, 40 Zyklen von 94 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 68 °C C für 1 Minute; und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 7 Minuten. Die doppelsträngige RNA (dsRNA) wurde mit einem MEGAScript RNAi Kit (Thermo Fisher Scientific) synthetisiert und dann in RNase-freiem Wasser auf eine Konzentration von etwa 1800 ng/μl gelöst. Die dsRNA-Qualität wurde durch 1 % Agarosegelelektrophorese bestimmt und die dsRNA, die den Standards entsprach, wurde vor der Verwendung bei -80 °C gelagert. Jeder weiblichen Mücke wurden etwa 16 Stunden PE 0,5 μl dsRNA injiziert. Als Kontrolle diente dsRNA des verstärkt grün fluoreszierenden Proteins (dsEGFP) in ähnlichen Konzentrationen wie die Test-dsRNA. Drei Tage nach der Injektion wurden die Weibchen zur Gesamt-RNA-Extraktion und zum RT-qPCR-Assay gesammelt. Für die Behandlungs- und Kontrollgruppe wurden jeweils drei biologische Replikate verwendet, mit fünf weiblichen Mücken in einem Röhrchen.

Der Expressionsvektor pET-28a(+) wurde in unserem Labor gelagert [8] und der Klonstamm Trans-T1 und der Expressionsstamm BL21 wurden von TransGen Biotech Co., Ltd. (Peking, China) erworben. Für die cDNA-Synthese wurde die Gesamt-RNA erwachsener weiblicher Mücken nach 72 Stunden PIJ verwendet. Primer mit den Restriktionsstellen Not I und Nco I für die Klonierung der PNP-Kodierungssequenz (CDS) wurden mit der Primer Premier 5.0-Software entworfen (zusätzliche Datei 7: Tabelle S7). Die PCR wurde unter Verwendung von PrimeStar HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) wie folgt durchgeführt: 94 °C für 3 Minuten; gefolgt von 25 Zyklen von 94 °C 30 s, 65 °C 30 s und 72 °C 3 min; und 72 °C für 10 Min. Nach der Verifizierung durch doppelten Enzymverdau wurde das rekombinante Plasmid in den exprimierenden Stamm BL21 transformiert, um die prokaryotische Expression von PNP zu erleichtern. Zur Induktion wurde 0,1 % IPTG zugesetzt und die Mischung 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Das Protein wurde auf der Grundlage einer Affinitätschromatographie auf einer Ni2+-ionengebundenen Chromatographiesäule (General Electric Company, Boston, MA, USA) gereinigt und mit Imidazol in verschiedenen Konzentrationen (200 mM, 500 mM, 1 M, 2 M) eluiert. Das gereinigte Protein wurde zur Entfernung des Imidazols dialysiert und schließlich zur Herstellung des Antikörpers an Wuhan GeneCreate Biological Engineering Co., Ltd. (Wuhan, China) geschickt.

Die Mücken wurden gründlich in RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1 % Natriumdodecylsulfat [SDS], 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdesoxycholat und EDTA-frei) gemahlen Proteaseinhibitor；Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) unter Verwendung einer elektrischen Homogenisatormühle (TGrinder OSE-Y40; Tiangen Biotechnology Co., Ltd.). Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem BCA Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) auf einem Mikroplattenlesegerät (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Für jede Probe wurden 40 ng Gesamtprotein (Lysat) mit einem Fünftel Volumen 5×SDS-Ladepuffer gemischt und dann 10 Minuten lang in einem Wasserbad bei 100 °C gekocht, gefolgt von der Trennung in 12 % SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese ( PAGE)-Gele, Übertragung der Elektrophoreseprodukte auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran und anschließende Blockierung der Membran mit 5 % Magermilch bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Der mit 1× Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20-Puffer (TBST, pH 7,4) im Verhältnis 8000:1 verdünnte Primärantikörper wurde zu 1 % fettfreiem Milchpulver, zubereitet mit 1× TBST, gegeben und über Nacht bei 4 °C oder bei Raumtemperatur inkubiert 1 Std. Die Blots wurden dreimal mit 1× TBST jeweils 10 Minuten lang gewaschen und dann mit 0,2 μg/ml Anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt mit TBST im Verhältnis 10.000:1, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Blots 6 Mal mit 1× TBST jeweils 10 Minuten lang gewaschen. Spezifische Banden wurden mit einem Clarity Western ECL-Substrat entwickelt und mit ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) nachgewiesen. Die densitometrische Analyse der dem PNP entsprechenden Proteinbanden wurde mit Image J Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) quantifiziert. Tubulin (AT819; Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) diente als Ladungskontrolle in Western-Blot-Experimenten.

Der Triglyceridgehalt (TGs) wurde mit dem TG Colourimetric Assay Kit (Kat.-Nr.: D799796-0100; Sangon Biotech, Shanghai, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Kurz gesagt, die Fettkörper von acht weiblichen Mücken 36 Stunden nach der Blutmahlzeit (PBM) wurden als ein biologisches Replikat für dsPNP oder dsEGFP geerntet und gründlich in 240 µl Lysepuffer (Mischung aus n-Heptan und Isopropanol in einem 1 :1 Volumenverhältnis) mit einem elektrischen Homogenisator (TGrinder OSE-Y40; Tiangen Biotech Co., Ltd.), gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 12.000 g, um die Fettschicht zu entfernen. Eine 120-µl-Probe des Überstands wurde in ein neues 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und nacheinander mit den im TG Colorimetric Assay Kit enthaltenen Reagenzien 1–6 behandelt, bevor der Absorptionswert bei 420 nm auf dem Assay-Instrument (GloMax®-Multi) gemessen wurde Instrument YNERGY H4; Promega).

Die ATP-Spiegel wurden mit dem ATP Assay Kit (Kat.-Nr.: S0026; Beyotime Biotechnology Co., Ltd.) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt wurden die Fettkörper von acht weiblichen Mücken bei 36-Stunden-PBM in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen als ein biologisches Replikat gepoolt, gefolgt vom Einmahlen von 120 μl Lysat mit einem elektrischen Homogenisator (TGrinder OSE-Y40; Tiangen Biotech Co., GmbH.). Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 16.000 g und 4 °C wurde der Überstand in ein neues 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und 100 μl des verdünnten ATP-Nachweisreagenzes in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte gegeben. Die Platte wurde 3–5 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten, so dass das Hintergrund-ATP bei der Reaktion verbraucht wurde. Anschließend wurden 20 μl der überstehenden Probe oder Standardprobe in jede Vertiefung gegeben, schnell gemischt und mindestens 2 s lang bei Raumtemperatur gehalten. Anschließend wurde die relative Lichteinheit (RLU) mit einem ELISA-Lesegerät (GloMax®-Multi) gemessen Instrument; Promega). Der ATP-Gehalt in jeder Probe wurde anhand der Standardkurve berechnet, die durch die folgenden Konzentrationsgradienten der ATP-Standardlösung erstellt wurde: 0,1 μM, 0,15 μM, 0,3 μM, 0,65 μM, 1,5 μM und 3 μM. Alle Werte wurden auf die Kontrollgruppe normalisiert.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt und die Werte als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt und jedes Experiment umfasste mindestens drei Behandlungen. Die Fehlerbalken wurden aus experimentellen Replikaten generiert. Der mittlere Zyklusschwellenwert (Ct) wurde mithilfe der 2−ΔΔCt-Methode in das relative Expressionsniveau umgerechnet [29, 30]. Statistische Analysen der Expressionsniveaus wurden unter Verwendung eines zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Tests durchgeführt. Signifikante Unterschiede wurden als *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001 definiert.

Wir sammelten die mit Ant-1174 injizierten Mücken und Kontrollmücken vor einer Blutmahlzeit bei 72 Stunden PIJ (Abb. 1a) für den RT-qPCR-Assay der miR-1174-Expression. Sowohl unsere früheren Studien [7] als auch das vorliegende Experiment zeigten, dass das Expressionsniveau miR-1174 durch die Injektion von Ant-1174 signifikant reduziert wurde (Abb. 1b). Drei Tage nach der Behandlung hatte sich die Injektionswunde vollständig erholt und es gab keine Unterschiede in der ormiR-1174-Expression des Mückenphänotyps zwischen der Ant-Ct-injizierten Gruppe und der nicht injizierten Wildtyp-Gruppe (Abb. 1a, b). [7]. Für die Proteomanalyse wurden drei biologische Replikate von Ant-1174-injizierten und Ant-Ct-Kontrollmücken gesammelt. In diesen sechs Proben wurden insgesamt 5892 Proteine ​​nachgewiesen, von denen nach Datenfilterung und Normalisierung 5875 Proteine ​​übrig blieben. Unter Verwendung einer differentiellen Proteinexpressionsanalyse mit den Kriterien P-Wert < 0,05 und Fold-Change < 0,83 oder > 1,2, wie sie in anderen Studien verwendet wurden [13, 14, 15, 16], ermittelten wir 383 DEPs, von denen 258 hochreguliert waren und 125 wurden herunterreguliert (Abb. 1c; Zusatzdatei 8: Tabelle S8). Eine hierarchische Clusteranalyse zeigte, dass diese 383 DEPs in hochregulierte und herunterregulierte Gruppen unterteilt waren und dass sich die Ant-1174-Gruppe von der Kontrollgruppe unterschied (Abb. 1d); Daher verursachte die Depletion von miR-1174 im Wesentlichen eine globale Proteinexpressionsreaktion bei Mücken.

Wir führten eine funktionelle Anreicherungsanalyse dieser 383 DEPs durch GO durch und stellten fest, dass 137, 166 und 88 DEPs an biologischen Prozessen, zellulären Komponenten bzw. molekularen Funktionen angereichert waren (Abb. 1e). Die Funktionsanalyse der DEPs zeigte, dass der katalytische Aktivitätsweg der am stärksten angereicherte biologische Prozess unter den DEPs war, gefolgt vom Hydrolase-Aktivitätsweg. Die Serin-bezogenen Signalwege Serin-Hydrolase-Aktivität, Serin-Typ-Peptidase und Serin-Typ-Endopeptidase-Aktivität wurden ebenfalls angereichert. Die Funktionsanalyse legte außerdem nahe, dass der Abbau von miR-1174 den Aminosäurestoffwechsel und die katalytische Reaktion anderer Enzyme beeinflusste. Die Analyse der KEGG-Signalweganreicherung zeigte, dass fünf Proteine ​​im Lysosomenweg (aag04142), zwei Proteine ​​im Fettsäureverlängerungsweg (aag00062) und zwei Proteine ​​im Stärke- und Saccharosestoffwechselweg (aag00500) angereichert waren (Abb. 1f). ). Im angereicherten Lysosomenweg wurden vier Proteine ​​hochreguliert (AAEL010765, AAEL012341, AAEL006854 und AAEL004120) und eines herunterreguliert (AAEL006390) (Abb. 1f). Zusammenfassend lassen die Ergebnisse sowohl der GO-Anreicherungsanalyse als auch der KEGG Pathway-Anreicherungsanalyse darauf schließen, dass miR-1174 eine wichtige regulatorische Rolle im Aminosäurestoffwechsel, Nukleotidstoffwechsel, Fettsäurestoffwechsel und Zuckerstoffwechsel spielt.

Screening unterschiedlich exprimierter Proteine ​​nach miR-1174-Depletion. a Ant-1174-injizierte Mücken und Kontrollen nach 72 Stunden PIJ. b miR-1174-Spiegel in den mit Ant-1174 injizierten Mücken und Kontrollen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten angezeigt. c Vulkandiagramm (Fachänderung > 1,2 oder < 0,83, P < 0,05), das die Proteine ​​veranschaulicht, die zwischen der Ant-1174- und der Kontrollgruppe unterschiedlich exprimiert werden. Die deutlich hochregulierten, differenziell exprimierten Proteine ​​sind in Rot dargestellt, die deutlich herunterregulierten, differenziell exprimierten Proteine ​​sind in Blau dargestellt und die Proteine ​​ohne signifikanten Unterschied sind in Grau dargestellt. d Hierarchische Clusteranalyse der unterschiedlich exprimierten Proteine, visualisiert als Heatmap. Die Farbblöcke an verschiedenen Positionen stellen die relative Expression der entsprechenden Proteine ​​dar: Rot steht für hohe Expression und Blau für niedrige Expression. e Blasendiagramm, das die GO-Anreicherung von Ant-1174 im Vergleich zur Kontrolle zeigt. f KEGG-Signalwege, angereichert durch unterschiedlich exprimierte Proteine ​​zwischen Ant-1174 und der Kontrollgruppe. Ant-1174/Ant-Ct, Antisense-Oligonukleotide (Antagomire) Ant-1174/Ant-Ct; BP, biologischer Prozess; CC, zelluläre Komponente; GO, Genontologie; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MF, molekulare Funktion; miRNA-1174, microRNA-1174; PIJ, Nachinjektion; WT, Wildtyp

Als nächstes führten wir eine ungezielte Metabolomikanalyse der Ant-1174- und Kontrollgruppen durch, um die unterschiedlichen Metaboliten aufzuklären, die aus der miR-1174-Depletion in Ae resultierten. Aegypti-Mücken. Alle Proben im PCA-Score-Diagramm lagen innerhalb des 95 %-KI (Abb. 2a), was bestätigt, dass das PCA-Modell für unsere Daten statistisch zuverlässig war. In ähnlicher Weise lagen laut OPLS-DA-Diagramm alle Proben innerhalb des 95 %-KI mit R2Y = 0,988 und Q2 = 0,931 (Abb. 2b), was bestätigt, dass das OPLS-DA-Modell zur Identifizierung der Differenzmetaboliten zuverlässig war. Darüber hinaus waren im Ersatztestdiagramm die R2Y- und Q2-Werte des ursprünglichen OPLS-DA-Modells größer als die R2Y- und Q2-Werte des Ersatztestdiagramms und der Schnittpunkt der Q2-Regressionslinie und der vertikalen Achse war kleiner als Null (Abb. 2c). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das etablierte OPLS-DA-Modell nicht überangepasst war und eine gute Vorhersagbarkeit aufwies.

Metabolomisches Profiling von miR-1174-depletierten Mücken. a Score-Streudiagramm des PCA-Modells für Gruppen mit Qualitätskontrolle. Alle Stichproben lagen innerhalb des 95 %-Konfidenzintervalls (Hotellings T-Quadrat-Ellipse). b Score-Streudiagramm des OPLS-DA-Modells für Ant-1174 vs. Kontrolle. c Permutationstest des OPLS-DA-Modells zwischen Ant-1174 und Kontrollgruppen. Achsenabschnitte: R2Y(cum) = (0, 0,79), Q2(cum) = (0, − 0,97). d Vulkandiagramm unterschiedlicher Metaboliten. Rote Punkte stellen hochregulierte Metaboliten dar, blaue Punkte sind herunterregulierte. Die X-Achse zeigt die log2-fache Änderung an und die Y-Achse misst den − log10 P-Wert. e Heatmap unterschiedlicher Metaboliten. Herunterregulierte Metaboliten werden blau hervorgehoben und oben links gruppiert, hochregulierte Metaboliten werden rot dargestellt und unten links gruppiert. f Klassifizierung von hochregulierten Metaboliten und herunterregulierten Metaboliten. g KEGG-Wege, angereichert mit den Differenzialmetaboliten. Die Kreisgröße ist direkt proportional zur Anzahl der Differenzmetaboliten; Die Rottiefe ist umgekehrt proportional zum P-Wert. h Stoffwechselweganalyse unterschiedlicher Metaboliten. Im Blasendiagramm stellt jede Blase einen Stoffwechselweg dar, und die Größe der Blase stellt die Einflussfaktorgröße des Weges in der topologischen Analyse dar. Ant-1174, Antisense-Oligonukleotid (Antagomire) Ant-1174; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; miR-1174, microRNA-1174; OPLS-DA, orthogonale Projektionen auf latente Strukturen – Diskriminanzanalyse; PCA, Hauptkomponentenanalyse

Das differenzielle Screening nach VIP (in einem OPLS-DA-Modell) > 1 und P-Wert (in einem Student-t-Test) < 0,05 ergab 292 differenzielle Metaboliten, von denen 141 hochreguliert und 151 herunterreguliert waren (Abb. 2d; Zusatzdatei 9: Tabelle S9). Eine hierarchische Clusteranalyse dieser unterschiedlichen Metaboliten zeigte, dass Proben derselben Gruppe in einer Gruppe geclustert waren und Proben verschiedener Gruppen voneinander getrennt waren (Abb. 2e; Zusatzdatei 10: Tabelle S10). Die hochregulierten Metaboliten konnten in 10 Superklassen eingeteilt werden, von denen die fünf wichtigsten organische Säuren und ihre Derivate waren; Lipide und lipidähnliche Moleküle; organoheterozyklische Verbindungen; organische Sauerstoffverbindungen; und Benzoloide (Abb. 2f; Zusatzdatei 11: Tabelle S11). Die herunterregulierten Metaboliten konnten in 11 Superklassen eingeteilt werden, von denen die fünf wichtigsten organische Sauerstoffverbindungen waren; organische Säuren und Derivate; Lipide und lipidähnliche Moleküle; organoheterozyklische Verbindungen; und Nukleoside, Nukleotide und Analoga (Abb. 2f; Zusatzdatei 11: Tabelle S11). In der Superklasse der organischen Säuren und Derivate gehörten 41 Metaboliten (76 %) des POS-Modus und 24 Metaboliten (69 %) des NEG-Modus zur Unterklasse Aminosäuren, Peptide und Analoga. In der Superklasse organischer Sauerstoffverbindungen gehörten acht Metaboliten (62 %) des POS-Modus und 29 Metaboliten (81 %) des NEG-Modus zur Unterklasse Kohlenhydrate und Kohlenhydratkonjugate. Anschließend führten wir eine KEGG-Signalweganreicherungsanalyse dieser DEMs durch (Abb. 2g; Zusatzdatei 12: Tabelle S12), die ergab, dass die DEMs hauptsächlich im Signalweg Aminoacyl-tRNA-Biosynthese angereichert waren, gefolgt vom Purinstoffwechsel, Glycerophospholipidstoffwechsel und Galaktosestoffwechsel , Pyrimidin-Stoffwechsel, Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechsel, Arginin- und Prolin-Stoffwechsel, Pentose- und Glucuronat-Umwandlungen, Alanin-, Aspartat- und Glutamat-Stoffwechsel, Cystein- und Methionin-Stoffwechsel, Lysinabbau, Aminozucker- und Nukleotidzucker-Stoffwechsel, Sphingolipid-Stoffwechsel und Glyoxylat- und Dicarboxylat-Stoffwechsel .

Im Purinstoffwechselweg wurden Urat- und Hypoxanthinribonukleotide hochreguliert und Glyoxylat, D-Ribose-5-phosphat, Adeninnukleosiddiphosphat, Adenosin-3′,5′-diphosphat, Adenosin, Aminimidazol-Riosse und 3′-Adenosinphosphat herunterreguliert. Uracil-Ribonukleotide, Cytosin-Ribonukleotide und Cytidin im Pyrimidin-Stoffwechselweg wurden ebenfalls herunterreguliert. Im Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechselweg wurden L-Threonin und Aminoaceton hochreguliert, während Phosphat-l-Serin, Phosphat-l-Hyperserin und L-Serin herunterreguliert wurden. Serin ist ein wichtiger Vorläufer für die Synthese von Purinen, Pyrimidinen und Phospholipiden, und eine Herunterregulierung von Serin und seinen Derivaten könnte die DNA-Replikation beeinträchtigen. Weitere Analysen zeigten, dass die Wege, die am engsten mit der Herunterregulierung von miR-1174 zusammenhängen, der Phenylalanin-, Tyrosin- und Tryptophan-Biosyntheseweg und der Phenylalanin-Stoffwechselweg waren. Auf diesen Wegen wurden L-Phenylalanin und Phenylacetaldehyd hochreguliert und L-Tyrosin und D-Erythrose-4-phosphat herunterreguliert (Abb. 2h).

Die Herunterregulierung von miR-1174 veränderte auch die Anreicherung von Verbindungen im Purin-Metabolismus (aag00230) und im Pyrimidin-Metabolismus (aag00240). Im Purinstoffwechselweg wurden D-Ribose-5-phosphat, ADP, Adenosin, Adenosin-3',5'-diphosphat, Aminoimidazol-Ribonukleotid und 3'-AMP herunterreguliert. Im Pyrimidin-Weg wurde 4,5-Dihydroorotsäure hochreguliert und Uridin-5'-monophosphat, Cytidinmonophosphat, Cytidin und Beta-Alanin herunterreguliert. Wir spekulieren daher, dass die abnormalen Phänotypen, die bei miR-1174-depletierten Mücken beobachtet wurden, durch eine weit verbreitete Störung verursacht werden könnten, die sowohl Aminosäuren als auch Nukleotide betrifft.

Angesichts der Tatsache, dass viele DEPs und DEMs an Aminosäurestoffwechsel-, Purinstoffwechsel- und Pyrimidinstoffwechselwegen angereichert waren, konzentrierten wir uns bei der integrativen Analyse von DEPs und DEMs auf diese drei Wege (Abb. 3). Bemerkenswert ist, dass im Purinstoffwechselweg (aag00230) die assoziierten Proteine ​​Purinnukleosidphosphorylase (PNP, aag5574096) und GTP:AMP-Phosphotransferase AK3 (PAK3, aag5564849) zusammen mit den assoziierten hochregulierten Metaboliten Inosinsäure oder Inosinmonophosphat (IMP) hochreguliert wurden , cpdC00130) und Harnsäure oder Urat (cpdC00366), während die damit verbundenen herunterregulierten Metaboliten ADP (cpdC00008), Glyoxylat (cpdC00048), Adenosin-3',5'-bisphosphat (cpdC00054), D-Ribose-5-phosphat (cpdC00117) waren, Adenosin (cpdC00212), 3'-AMP (cpdC01367) und Aminoimidazolribotid (AIR, cpdC03373). Im Pyrimidin-Stoffwechselweg (aag00240) war das zugehörige hochregulierte Protein PNP (aag5574096) und der zugehörige hochregulierte Metabolit war 4,5-Dihydroorotsäure oder (S)-Dihydroorotat (cpdC00337). Im Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechselweg (aag00260) waren die assoziierten Proteine ​​Glycin-N-Methyltransferase (GNMT, aag5576784) und Sarkosin-Dehydrogenase (AARDH, aag5565677) sowie die assoziierten Metaboliten L-Threonin (cpdC00188) und Betain (cpdC00719) hochreguliert ) und Aminoaceton (cpd C01888) wurden hochreguliert, während die assoziierten Metaboliten Glyoxylsäure oder Glyoxylat (cpdC00048), L-Serin (cpdC00065), 2-Oxobutanoat (cpd C00109), D-Glycerat (cpd C00258), O-Phospho-l -Serin (cpdC01005) und O-Phospho-l-homoserin (cpdC01102) wurden herunterreguliert. Zusammen spielen diese assoziierten DEPs und DEMs eine wichtige Rolle im Aminosäurestoffwechsel und DNA-Stoffwechsel. Daher ist es möglich, dass der Abbau von miR-1174 weitreichende Auswirkungen auf die Stoffwechselwege von Aminosäuren und Nukleotiden in Mücken hat und sich folglich auf die Blutsaugung, die Blutverdauung und die Entwicklung der Eierstöcke auswirkt.

Zielgene von miR-1174. a Voraussichtliche Bindungsstelle innerhalb der 3'-UTR des Serinproteaseinhibitors 27A (SPI27A, AAEL014079). b Dual-Luciferase-Reporter-Assay der Bindungsstelle innerhalb der 3'-UTR von SPI27A-mRNA. c Vorhergesagte Bindungsstelle innerhalb der 3′-UTR der MCT12-mRNA. d Dual-Luciferase-Reporter-Assay der Bindungsstelle innerhalb der 3'UTR von MCT12-mRNA. e Voraussichtliche Bindungsstelle innerhalb der 3'-UTR von uncharakteristisch (UC, AAEL015019). f Dual-Luciferase-Reporter-Assay der Bindungsstelle innerhalb der 3'UTR von UC-mRNA. g Dual-Luciferase-Reporter-Assay zur Überprüfung, ob miR-1174 auf die 5'-UTR der PNP-mRNA abzielt. h Dual-Luciferase-Reporter-Assay zur Überprüfung, ob miR-1174 auf das CDS der PNP-mRNA abzielt. i Dual-Luciferase-Reporter-Assay zur Überprüfung, ob miR-1174 auf die 3'UTR der PNP-mRNA abzielt. Fehlerbalken zeigen ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Sternchen geben die statistische Signifikanz bei *P < 0,05 und **P < 0,01 an; ns, nicht signifikant. CDS, Codierungssequenz; miR-1174, microRNA-1174; UTR, nicht übersetzte Region; mRNA, Messenger-RNA; PNP, Purinnukleosidphosphorylase; SEM, Standardfehler des Mittelwerts; 3′-UTR, 3′-untranslatierte Region

Die mit vier Programmen vorhergesagten Zielkandidaten (siehe Methoden) wurden mit allen hochregulierten Proteinen in den miR-1174-depletierten Mücken gekreuzt, was drei Zielkandidaten ergab: Serinproteaseinhibitor 27A (SPI27A, AAEL014079), Monocarboxylattransporter 12 (MCT12, AAEL002412) und uncharakteristisch (UC, AAEL015019). Die 3'-UTR-Sequenzen von SPI27A, MCT12 und UC wurden durch 3'-RACE erhalten und jeweils in den psiCHECKTM-2-Vektor kloniert. HEK-293T-Zellen wurden mit dem rekombinanten Plasmid und einem miR-1174-Mimetikum co-transfiziert. Die Aktivität der Firefly-Luciferase (Fluc) und der Renilla-Luciferase (Rluc) wurde 48 Stunden nach der Transfektion nachgewiesen. Die Ergebnisse des Dual-Luciferase-Reportergen-Assays zeigten, dass das Rluc/Fluc-Verhältnis signifikant niedriger war als das der Kontrollgruppe, was zeigte, dass SPI27A, MCT12 und UC Zielgene von miR-1174 waren (Abb. 3a – f). Wir haben die vorhergesagten Zielstellen von miR-1174 innerhalb ihrer 3'-UTRs weiter mutiert, und die Ergebnisse des Dual-Luciferase-Reportergen-Assays zeigten, dass sich die Luciferase-Aktivität nach der Stellenmutation erholte, was darauf hinwies, dass die mutierte Stelle das Ziel von miR-1174 war (Abb. 3a–f). Diese drei Ziele wurden durch Injektion doppelsträngiger RNAs (dsRNAs) ausgeschaltet, bei den Mücken wurden jedoch keine abnormalen Phänotypen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Ob diese drei Zielgene bei Mücken wichtige Funktionen haben, muss durch Gen-Knockout oder Überexpression weiter bestätigt werden.

Eine integrative Analyse der DEPs und DEMs zeigte, dass PNP (AAEL002269) mit den Signalwegen für den Purinstoffwechsel, Pyrimidinstoffwechsel und Niacin-Nicotinamid-Stoffwechsel assoziiert ist (Abb. 4), was darauf hindeutet, dass PNP möglicherweise eine wichtige Rolle bei Mücken spielt. Daher untersuchten wir räumlich-zeitliche Expressionsmuster des PNP-Gens mittels RT-qPCR und Western-Blot-Assays. Weibliche erwachsene Mücken wurden zu 14 Zeitpunkten für RT-qPCR-Assays gesammelt; Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von PNP schnell anstieg, nachdem Mücken eine Blutmahlzeit zu sich genommen hatten, wobei der höchste Expressionsgrad bei 6 Stunden PBM und der niedrigste Expressionsgrad bei 48 Stunden PBM lag (Abb. 5a). Der Proteingehalt von PNP war stark erhöht, erreichte nach 12 bis 24 Stunden PBM ein Plateau und sank dann nach 48 Stunden PBM auf einen Tiefpunkt; Dieser Trend war im Vergleich zum mRNA-Spiegel etwas verzögert (Abb. 5b). Um die räumliche Expression von PNP zu bestimmen, haben wir verschiedene Gewebe bei 72 Stunden PE und 6 Stunden PBM für RT-qPCR- und Western-Blot-Assays gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass PNP im Fettkörper und im Kopf in hohen Mengen exprimiert wurde und im Mitteldarm und Eierstock niedrige Expressionsniveaus aufwies (Abb. 5c, d). PNP wurde als Reaktion auf die Erschöpfung von miR-1174 signifikant induziert (Abb. 5e), was darauf hindeutet, dass miR-1174 PNP möglicherweise negativ reguliert. Wir sagten dann die Bindungswechselwirkung zwischen miR-1174 und PNP voraus, fanden jedoch keine Zielstellen innerhalb der 5'-UTR, CDS oder 3'-UTR der PNP-mRNA, ein Ergebnis, das durch die Ergebnisse des Dual-Luciferase-Reportergen-Assays weiter bestätigt wurde (Abb. 3g–i).

Integrierte Analyse unterschiedlich exprimierter Proteine ​​und Metaboliten. Rot zeigt eine Hochregulierung und Blau eine Herunterregulierung an. Die gepunktete Linie zeigt mehrstufige Reaktionen und die durchgezogene Linie zeigt einstufige Reaktionen an. Der Zwei-Wege-Pfeil stellt die Äquivalenz zwischen verschiedenen Szenarien dar, während der Einweg-Pfeil eine unidirektionale Transformation zwischen Substrat und Produkt oder von einem Metaboliten zu einem anderen bedeutet. AIR, Aminoimidazolribotid; IMP, Inosinmonophosphat; PAK3, GTP:AMP-Phosphotransferase; PNP, Purinnukleosidphosphorylase; GNMT, Glycin-N-Methyltransferase; SARDH, Sarkosin-Dehydrogenase

Ausdruck von PNP. eine RT-qPCR-basierte zeitliche Expression von PNP in erwachsenen weiblichen Mücken. b Western-Blot-Analyse von PNP in erwachsenen Mücken. Zum Vergleich mit den mRNA-Spiegeln in a wurden die Signale der Western-Blot-Ergebnisse (unten) mithilfe der Image J-Software in Zahlen umgewandelt, um die Proteinexpression zu quantifizieren (oben). c RT-qPCR-basierter räumlicher Ausdruck bei 72 h PE. d RT-qPCR-basierter räumlicher Ausdruck bei 6 h PBM. e Expression von PNP als Reaktion auf die Erschöpfung von miR-1174. Zur Gewebeentnahme wurden die Weibchen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung präpariert und die Blutboli aus dem Mitteldarm entnommen. RPS7 wurde als Kontrolle für RT-qPCR und Tubulin als Kontrolle für Western Blot verwendet. Alle Diagramme werden als Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten dargestellt. Unterschiede bei P < 0,05 waren statistisch signifikant, und Unterschiede bei P < 0,01 wurden als hoch statistisch signifikant angesehen. FB, Fetter Körper; HD, Kopf; LO, übrig geblieben; Mg: Mitteldarm; miR-1174, microRNA-1174; PBM, Postblutmahlzeit; PE, Nacheklosion; PNP, Purinnukleosidphosphorylase; RT-qPCR, quantitative Echtzeit-PCR; SEM, Standardfehler des Mittelwerts

Um die Funktion von PNP in Ae aufzudecken. Aegypti-Mücken injizierten wir die dsRNA von PNP nach etwa 12–20 h PE und bestätigten deren Herunterregulierung durch RT-qPCR- und Western-Blot-Assays (Abb. 6a – d). Die PNP-Stummschaltung hatte keinen Einfluss auf die Zuckerabsorption oder die Blutaufnahme, und nach 6 Stunden PBM wurden bei dsPNP-injizierten Frauen im Vergleich zu den Kontrollproben keine offensichtlichen Veränderungen in der Morphologie beobachtet. Bei diesen mit dsPNP injizierten Weibchen traten jedoch ab der 12-stündigen PBM abnormale Phänotypen in der Blutverdauung und im Eierstockwachstum auf (Abb. 6e). Genauer gesagt zeigten mit dsPNP injizierte Mücken eine langsamere Blutverdauung und kleinere Eierstöcke im Vergleich zu mit dsEGFP injizierten Weibchen und Wildtyp-Kontrollen. Die Unterschiede in der Blutfarbe und der Eierstockgröße waren bei 24-Stunden-PBM deutlicher. Als die Mücken nach 48 und 72 Stunden PBM präpariert wurden, war bei den Mücken in den beiden Kontrollgruppen fast kein Blut mehr im Mitteldarm verblieben und die Eierstöcke zeigten eine normale Entwicklung; Im Vergleich dazu war bei Mücken in der dsPNP-Gruppe mindestens die Hälfte des aufgenommenen Blutes unverdaut und die Entwicklung der Eierstöcke stagnierte. Bemerkenswert ist, dass Mücken mit PNP-Mangel nach 15 Stunden PBM zu sterben begannen, die Hälfte von ihnen war innerhalb von 48 Stunden PBM gestorben und fast alle waren innerhalb von 72 Stunden PBM gestorben (Abb. 6f). Schließlich wurde bei dsPNP-injizierten Weibchen im Vergleich zu Eiern, die von WT- und dsEGFP-injizierten Weibchen gesammelt wurden, eine durchschnittliche 100-fache Verringerung der Eiablage beobachtet (Abb. 6g, h).

Abnormale Phänotypen, die durch PNP-Knockdown verursacht werden. Ein RT-qPCR-Ergebnis, das den Abbau von PNP nach 72 h PE zeigt. b RT-qPCR-Ergebnisse, die den Abbau von PNP nach 6 Stunden PMB zeigen. c Western-Blot-Ergebnisse, die den Abbau von PNP nach 72 h PE zeigen. d Western-Blot-Ergebnisse, die den Abbau von PNP nach 6 Stunden PBM zeigen. e Phänotypen, die durch PNP-RNA-Interferenz verursacht werden. f Statistik der Eiablage (N = 10 Weibchen × 6 biologische Replikate). g Statistik der Blutsaugrate (N = 40 Weibchen × 4 biologische Replikate). H. Statistik der Überlebensrate bei 72-Stunden-PBM (N = 60 Frauen pro Gruppe × 3 Wiederholungen). RPS7 wurde als Kontrolle für RT-qPCR und dsEGFP als Kontrolle für RNA-Interferenz verwendet. Fehlerbalken zeigen ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Unterschiede bei P < 0,05 wurden als statistisch signifikant und Unterschiede bei P < 0,01 als hoch statistisch signifikant angesehen. dsEGFP, doppelsträngige RNA eines verstärkt grün fluoreszierenden Proteins; dsPNP, doppelsträngige RNA der Purinnukleosidphosphorylase; PBM, Postblutmahlzeit; PE, Nacheklosion; RT-qPCR, quantitative Echtzeit-PCR; RPS7, ribosomales Protein S7; SEM, Standardfehler des Mittelwerts; WT, Wildtyp

Nach der PNP-Herunterregulierung wurden die Blutverdauung der Mücken und die Entwicklung der Eierstöcke stark gehemmt. Um den möglichen molekularen Mechanismus von PNP in diesen physiologischen Prozessen zu verstehen, untersuchten wir die Transkriptionsebene einer Reihe von Genen, von denen bekannt ist, dass sie in den Signalwegen wirken, die an der Eizellenentwicklung beteiligt sind (Abb. 7). Die Entwicklung der Eierstöcke hängt von der Synthese des Vitellogenin (Vg)-Proteins im Fettkörper ab [31]. Wir fanden heraus, dass das Vg-Expressionsniveau bei 24-Stunden-PBM bei den PNP-depletierten Mücken signifikant herunterreguliert war (Abb. 7a). Die Synthese von Vg ist hauptsächlich mit der Signalübertragung von Juvenilhormonen, Ecdyson, insulinähnlichen Peptiden und Aminosäurenährstoffen verbunden [32,33,34,35]. PNP wird in bluternährten Mücken stark exprimiert und daher könnte PNP bei Mücken nach Blutabsorption funktionieren; Im Vergleich dazu beeinflusst der Juvenilhormon-Signalweg im Allgemeinen die Entwicklung des Eierstocks vor der Blutaufnahme. Die Untersuchung der Transkriptniveaus einiger Schlüsselgene bei der Ecdyson-Signalisierung, der Insulin-ähnlichen Peptid-Signalisierung und der Aminosäure-Nährstoff-Signalisierung bei 24-Stunden-PBM ergab, dass EcR und E75A hochreguliert und E74B herunterreguliert waren (Abb. 7b – d), das Insulin-ähnliche Signal Die Peptidweg-Gene MIR (Mückeninsulinrezeptor) und PI3K (Phosphatidylinositol-3-Kinase) waren hochreguliert (Abb. 7e, f), aber ILP3 (insulinähnliches Peptid 3) und FoxO (Forkhead Box O) blieben unverändert (Daten nicht gezeigt). . TOR (Ziel von Rapamycin), ein Schlüsselgen des Signalwegs für Aminosäurenährstoffe, zeigte keine signifikante Veränderung im Expressionsniveau (Abb. 7g). Wichtige Gene im apoptotischen Signalweg, nämlich Dronc und Caspase8, wurden deutlich hochreguliert (Abb. 7h, i), was darauf hindeutet, dass der apoptotische Signalweg aktiviert sein könnte. Tatsächlich zeigte eine große Anzahl von Zellen einen programmierten Tod, was zum massiven Tod weiblicher Mücken nach 36 Stunden PBM führte.

Der Abbau von PNP bei Mücken verändert die Expression einiger Gene des Signalwegs und beeinflusst den Energiestoffwechsel. Dargestellt sind folgende Ausdrücke. ein Vitellogenin-Gen (Vg). b Ecdysteroid-Rezeptor-Gen (EcR). c Ecdyson-induziertes Protein-75A-Gen (E75A). d Ecdyson-induziertes Protein-74B-Gen (E74B). e Moskito-Insulinrezeptor-Gen (MIR). f Phosphoinositid-3-Kinase-Gen (PI3K). g Ziel des Rapamycin-Gens (TOR). h Todesregulator Nedd2-ähnliches Caspase-Gen (Dronc). i Autophagie-bezogenes 8-Gen (ATG8). j ATP-Spiegel bei 36 h PBM. k TG-Spiegel bei 72 h PE ohne Blutmahlzeit. l TG-Spiegel nach 36 Stunden PBM. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten dargestellt. Statistische Vergleiche zwischen Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von einem ungepaarten Student-t-Test durchgeführt. Unterschiede bei P < 0,05 wurden als statistisch signifikant und Unterschiede bei P < 0,01 als hoch statistisch signifikant angesehen. ANOVA, Varianzanalyse; dsEGFP, doppelsträngige RNA eines verstärkt grün fluoreszierenden Proteins; dsPNP, doppelsträngige RNA der Purinnukleosidphosphorylase; RPS7, ribosomales Protein S7; TG, Triglycerid; WT-Wildtyp

PNP-depletierte Mücken begannen nach 15 Stunden PBM ihre Flugfähigkeit zu verlieren und starben schließlich innerhalb von 72 Stunden PBM. PNP ist ein konserviertes Schlüsselenzym, das am Purinabbau und -verwertungsweg beteiligt ist und bei der Synthese von ATP helfen kann. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Herunterregulierung von PNP auch den Stoff- und Energiestoffwechsel in Fettkörpern beeinflussen könnte. Wie erwartet war der ATP-Gehalt der weiblichen Mücken mit PNP-Mangel weitaus niedriger als der der WT-Mücken (Abb. 7j). Lipide werden im Fettkörper gespeichert und die Verwendung von Lipiden für den Grundstoffwechsel erfordert eine kontinuierliche Mobilisierung von Triglyceriden (TG) aus dem Fettkörper in andere Gewebe. Die Fettkörper der dsPNP- und dsGEFP-injizierten Gruppen wurden sowohl nach 72 Stunden PE als auch nach 36 Stunden PBM geerntet, um den TG-Gehalt zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass vor der Blutfütterung keine signifikante Änderung des TG-Gehalts aufgetreten war (Abb. 7k), dass der TG-Gehalt bei den dsPNP-Mücken jedoch nach 36 Stunden PBM signifikant verringert war (Abb. 7l). Wir kamen daher zu dem Schluss, dass eine Herunterregulierung des PNP die Nährstoffverwertung und Energieumwandlung bei Mücken stören, den Nährstoffsignalweg im Fettkörper blockieren und die Entwicklung der Eierstöcke behindern könnte.

Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass Mücken, wenn das mücken- und mitteldarmspezifische miR-1174 zum Schweigen gebracht wird, Zucker und Blut nicht wie normal aufnehmen können, die Entwicklung der Eierstöcke gehemmt wird und infolgedessen die Reproduktionsrate der Mücken verringert wird; Alle diese abnormalen Phänotypen können durch RNAi-Knockdown des Zielgens SHMT teilweise wiederhergestellt werden [7]. Der SHMT-Knockdown hemmt jedoch nicht die Aufnahme von Zucker und Blut; Es hemmt lediglich die Verdauung, Absorption und Verwertung von Blut und beeinträchtigt so die Entwicklung der Eierstöcke und verringert die Eiablagerate [8]. Da SHMT durch miR-1174 negativ reguliert wird, sollten die abnormalen Phänotypen, die durch die Depletion von miR-1174 verursacht werden, logischerweise mit den abnormalen Phänotypen übereinstimmen, die nach SHMT-Überexpression beobachtet wurden, während miR-1174 nur auf SHMT abzielte, während dies bei den abnormalen Phänotypen nach SHMT-RNAi der Fall sein sollte im Einklang mit den Phänotypen, die durch die Überexpression von miR-1174 verursacht werden. Bisher ist jedoch nicht klar, ob SHMT das einzige Zielgen von miR-1174 in Mücken ist. Wir fanden heraus, dass miR-1174 nur im Mitteldarm von Mücken stark exprimiert wurde und dass es in anderen Geweben nicht oder nur in Spuren exprimiert wurde. Im Gegensatz dazu gab es keine oder nur eine Spurenexpression von SHMT im Mitteldarm, während es im Fettkörper außerhalb des Mitteldarms stark exprimiert wurde. Da miR-1174 und SHMT spezifisch in unterschiedlichen Geweben exprimiert werden, können zwischen ihnen andere Interaktionsmodi oder Signalwege bestehen. Daher haben wir in dieser Studie zu einem Zeitpunkt, an dem die erwachsenen Mücken vollständig ausgereift waren und sich vollständig von der Injektionswunde erholt hatten, mit Ant-1174 injizierte Mücken und Kontrollen für den proteomischen und metabolomischen Nachweis gesammelt, in der Erwartung, ein Screening auf DEPs und DEMs durchzuführen . Um den molekularen Mechanismus dieser miRNA als wichtiges regulatorisches Molekül in blutsaugenden Mücken weiter aufzudecken, haben wir die mit diesen DEPs und DEMs verbundenen Signalwege funktionell analysiert.

Sowohl die GO-Anreicherungsanalyse als auch die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse lieferten Hinweise darauf, dass miR-1174 hauptsächlich in den Stoffwechselwegen für Aminosäuren, Nukleotide, Fettsäuren und Zucker wirkt. Es ist zu beachten, dass diese DEPs zwar nach der Stummschaltung von miR-1174 entdeckt wurden, ihre unterschiedliche Expression jedoch nicht unbedingt direkt durch die Depletion von miR-1174 verursacht wird. Im Allgemeinen werden nur die Zielgene direkt durch diese miRNA reguliert, während die unterschiedliche Expression dieser Nicht-Zielgene viel wahrscheinlicher indirekt durch diese miRNA reguliert wird. In diesem Zusammenhang wurde bestätigt, dass unter den hochregulierten Proteinen nur SPI27A (AAEL014079), MCT12 (AAEL002412) und UC (AAEL015019) die Zielgene von miR-1174 sind (Abb. 3). Der RNAi-Knockdown dieser drei Zielgene verursachte bei den Versuchsmücken keine abnormalen Phänotypen. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis ist, dass der RNAi-Knockdown nicht ausreichte, um die Expression der entsprechenden Proteine, die bei Mücken wahrscheinlich noch funktionieren, vollständig zu verhindern. Zugegebenermaßen sind daher möglicherweise stärkere Beweise durch Knockout und Überexpression erforderlich, um die biologischen Funktionen dieser Zielgene bei Mücken zu bestimmen.

Um die biologische Rolle anderer, stärker auf miR-1174 reagierender Gene aufzudecken, haben wir sie mithilfe der RNAi-Technologie eines nach dem anderen ausgeschaltet und festgestellt, dass abnormale Phänotypen nur bei PNP-depletierten Mücken nach der Bluternährung beobachtet wurden. Der PNP-Abbau hatte keinen Einfluss auf die normale Blutaufnahme, aber die Blutverdauung und die Entwicklung der Eierstöcke wurden blockiert und die Lebensdauer der Mücken verkürzt. PNP wurde im Fettkörper stark exprimiert, daher gingen wir davon aus, dass seine Herunterregulierung den Nährstoffstoffwechsel im Fettkörper direkt beeinflussen würde. Vitellogenin-Protein (Vg) wird im Fettkörper synthetisiert und ist mit der Signalübertragung von Juvenilhormonen, Ecdyson, insulinähnlichen Peptiden und Aminosäurenährstoffen verbunden [35,36,37]. RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die PNP-Depletion zu einer signifikanten Herunterregulierung von Vg führte und dass auch der Ecdyson-Signalweg und der Insulin-ähnliche Peptid-Signalweg im Zusammenhang mit der Eierstockentwicklung betroffen waren. Es bleibt jedoch unklar, ob und wie PNP die Synthese und Expression von Vitellogenin über diese hormonellen Signalwege reguliert.

PNP wirkt in Stoffwechselwegen von Purin, Pyrimidin und Niacin-Nikotinamid; Insbesondere kann der Niacin-Nicotinamid-Stoffwechselweg NADH produzieren. Eine weitere oxidative Phosphorylierung von NADH kann eine große Menge ATP produzieren, um die Lebensaktivitäten aufrechtzuerhalten [38, 39]. Die Expression des PNP-Proteins wurde nach der Herunterregulierung von miR-1174 deutlich erhöht, was darauf hindeutet, dass miR-1174 direkt oder indirekt auf PNP abzielt. Allerdings deuteten sowohl die vorhergesagten Ergebnisse als auch die Ergebnisse der Dual-Luciferase-Reportertests darauf hin, dass PNP kein direktes Zielgen von miR-1174 war. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass miR-1174 PNP indirekt über andere Gene oder andere Signalwege reguliert. Störungen im Glycin-, Serin- und Threoninstoffwechsel wirken sich auf den Purinstoffwechsel aus und reduzieren AMP und ADP, was zu einer Abnahme von ATP führt [40]. Wir fanden heraus, dass die Erschöpfung von miR-1174 die Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechselwege sowie die Purin- und Pyrimidin-Stoffwechselwege beeinflusste, was darauf hindeutet, dass miR-1174 die Blutverdauung und die Eierstockentwicklung von Ae reguliert. Aegypti durch Beteiligung am Energie- und Nukleotidstoffwechsel.

PNP phosphoryliert Purinnukleoside reversibel in Purinbasen und Ribose-1-Phosphat in den Purin-Wiedergewinnungswegen, und ein PNP-Mangel führt zur Akkumulation von Purinnukleosiden [41]. Bei Säugetieren führt das Fehlen von PNP zu einem signifikanten Anstieg der Affinität der Desoxycytidinkinase (dCK) zu Desoxycytidin, was bedeutet, dass eine erhebliche Menge Desoxycytidintriphosphat (dGTP) synthetisiert wird und übermäßiges dGTP das Gleichgewicht der Desoxyribonukleotide stört, die DNA-Synthese beeinträchtigt, und induzieren T-Zell-Apoptose [42]. Ein Mangel an PNP führt zu einer Adenosinakkumulation und Apoptose von Tumorzellen [43]. Schlüsselgene im apoptotischen Signalweg wurden nach dem PNP-Knockdown entdeckt, und sowohl das Dronc- als auch das Caspase8-Gen waren deutlich hochreguliert. Caspase8 ist ein wichtiges Gen zur Auslösung der Apoptose, und seine Aktivierung kann andere bekannte Caspase-Gene aktivieren [44]. PNP-depletierte Mücken zeigten in vivo eine signifikante Herunterregulierung des ATP- und TG-Gehalts. Diese Mücken starben innerhalb von 48 Stunden nach der Blutinhalation, möglicherweise aufgrund des Mangels an ATP und TG, die den apoptotischen Weg aktivieren, was zu einem abnormalen programmierten Tod einer großen Anzahl von Zellen führte.

PNP wird im Mitteldarm und Eierstock leicht oder gar nicht exprimiert und im Kopf, Fettkörper und anderen Restgeweben stark exprimiert. Als es jedoch niedergeschlagen wurde, waren die Funktion des Mitteldarms und die Entwicklung der Eierstöcke stark beeinträchtigt. Die PNP-Stummschaltung wirkt sich möglicherweise zunächst auf den Fettkörper aus und die entsprechenden Signale werden dann an den Mitteldarm weitergeleitet. Dies würde dann die Expression von Verdauungsenzymen beeinträchtigen, was zu Störungen bei der Blutverdauung sowie der Nährstoffaufnahme und -verwertung führen würde, so dass nicht genügend Nährstoffe für die Synthese von Vitellogenin-Vorläufern vorhanden wären, was letztendlich zu einer abnormalen Entwicklung der Eierstöcke führen würde. Obwohl PNP in den miR-1174-depletierten Mücken deutlich hochreguliert war, fanden wir keine Bindungsstellen von miR-1174 innerhalb seiner 5'-UTR, CDS oder 3'UTR. Dies impliziert, dass PNP indirekt durch miR-1174 reguliert wird, das möglicherweise wichtige Lebensaktivitäten wie Zuckerabsorption, Blutaufnahme und -verdauung, Eierstockentwicklung und sogar die Lebensspanne reguliert, indem es mehrere Signalwege durch mehrere Zielgene synergetisch reguliert. Obwohl wir in dieser Studie DEPs identifiziert haben, sind noch weitere Studien erforderlich, um festzustellen, welche dieser DEPs direkt und welche indirekt durch miR-1174 reguliert werden und welche dieser Gene für verschiedene Arten abnormaler Phänotypen auf unterschiedlichen Reaktionsniveaus verantwortlich sind nach Herunterregulierung von miR-1174.

Diese Studie untersuchte den molekularen Mechanismus des mücken- und mitteldarmspezifischen miR-1174 in Ae.aegypti-Mücken. Mithilfe von Proteomik- und Metabolomik-Techniken identifizierten wir die DEPs und DEMs in miR-11174-depletierten Mücken. Ihre Funktionsanalyse zeigte, dass der Abbau von miR-1174 die Stoffwechselwege von Aminosäuren, Nukleotiden, Fettsäuren und Glukose beeinflusst. Um die Rolle einiger DEPs weiter zu untersuchen, wurde ein RNAi-Knockdown durchgeführt. Konkret haben wir uns für die Purinnukleosidphosphorylase (PNP, AAEL002269) entschieden, ein hochreguliertes Gen, das von miR-1174 nicht direkt angegriffen wird, aber wichtige Funktionen bei Mücken hat. Wenn PNP herunterreguliert wurde, wurde die Blutverdauung gehemmt, die Entwicklung der Eierstöcke behindert und die Lebensdauer der Mücken verkürzt. Die Herunterregulierung von PNP beeinflusst Hormonsignalwege, Apoptosewege und einige Nährstoffstoffwechselwege, was darauf hindeutet, dass PNP diese Signalwege regulieren könnte, um die Blutverdauung und die Entwicklung der Eierstöcke zu steuern. Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse die molekularen Veränderungen auf, die durch die Depletion von miR-1174 auf Proteom- und Metabolomebene verursacht werden, und legten die biologischen Rollen einiger DEPs fest. Als solche liefern sie wertvolle Einblicke in die Rolle einer linienspezifischen miRNA in den Regulierungswegen der Blutverdauung und der Nährstoffsignalisierung.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzdateien verfügbar.

Antisense-Oligonukleotide (Antagomire)

Differenziell exprimierte Proteine

Differenziell exprimierte Metaboliten

Gen-Ontologie

Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome

microRNA-1174

MicroRNA

Nach der Blutmahlzeit

Nachabschottung

Nach der Injektion

Purin-Nukleosid-Phosphorylase-Gen

RNA-Interferenz

Quantitative Echtzeit-PCR

Serin-Hydroxymethyltransferase-Gen

Tandem-Massen-Tag

3′-untranslatierte Region

3'-schnelle Amplifikation des cDNA-Endes

Doppelsträngige RNA eines verstärkt grün fluoreszierenden Proteins

Doppelsträngige RNA der Purinnukleosidphosphorylase

Wildtyp

Ribosomales Protein S7

Standardfehler des Mittelwerts

Fetter Körper

Kopf

übrig bleiben

Mitteldarm

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Wir danken der Firma BIOTREE (Shanghai, China) für die technische Unterstützung. Wir danken Marian Goldsmith (emeritierter Professor am Zentrum für Biotechnologie und Biowissenschaften der Universität Rhode Island) für die kritische Lektüre, die freundliche Diskussion und die konstruktiven Vorschläge.

Diese Arbeit wurde vom National Natural Science Foundation of China Grant (32172797), dem Chongqing Science and Technology Plan Project (2022NSCQ-MSX5897), dem Chongqing Graduate Research Innovation Project (CYB21132) und dem Chongqing Postgraduate Research Innovation Project (CYS22254) unterstützt.

Yangrui Luo, Dun Liu und Yuanmei Wang haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Staatliches Schlüssellabor für Ressourceninsekten, Southwest University, Beibei, Chongqing, 400716, Volksrepublik China

Yangrui Luo, Yuanmei Wang, Fan Zhang, Yankun Xu, Qian Pu, Lu Zhao, Tianqi Wei, Ting Fan, Yuqi Lou & Shipping Liu

College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao, 266003, Shandong, Volksrepublik China

Dun Liu

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SL konzipierte die Forschung, entwarf und führte Experimente durch und war maßgeblich an der Erstellung des Manuskripts beteiligt. YL, DL und YW führten Experimente durch, interpretierten die Daten und trugen zum Schreiben bei. FZ, YX, QP, LZ, TW, TF und YL züchteten die Mücken und trugen zum Schreiben bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Shiping Liu.

Die Experimente wurden gemäß den vom Southwest University Animal Care and Use Committee genehmigten Richtlinien durchgeführt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

. Die Originaldaten wurden aus 6 experimentellen Proben extrahiert.

. Nach der Vorbehandlung blieben 5875 Proteine ​​erhalten.

. Differenziell exprimierte Proteine ​​werden nach den beschriebenen Kriterien gescreent.

. Nach der Vorbehandlung blieben im POS-Modus 5714 Peaks erhalten.

. Nach der Vorbehandlung blieben im NEG-Modus 5609 Peaks erhalten.

. Nach der Vorbehandlung blieben 11270 Peaks im kombinierten POS- und NEG-Modus erhalten.

. In dieser Studie verwendete Primersequenzen.

. Alle differentiell exprimierten Proteine ​​(DEPs) nach dem Differentialscreening.

. Alle differenziellen Metaboliten (DEMs) nach differenziellem Screening.

. Datenmatrix für die hierarchische Clusterung von DEMs.

. Klassifizierungsinformationen von DEMs. Rot stellt hier die hochregulierten DEMs in jeder in Abb. 2F gezeigten Superklasse dar; Blau stellt die herunterregulierten DEMs in jeder in Abb. 2F gezeigten Superklasse dar.

. Pathway-Anreicherungsanalyse dieser DEMs.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Luo, Y., Liu, D., Wang, Y. et al. Die kombinierte Analyse des Proteoms und Metaboloms liefert Einblick in die Funktion von microRNA-1174 bei Aedes aegypti-Mücken. Parasites Vectors 16, 271 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05859-1

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Eingegangen: 17. Mai 2023

Angenommen: 30. Juni 2023

Veröffentlicht: 09. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05859-1

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